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一、原理

DNA在碱性的溶液中带有负电荷,因此,在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时,由于琼脂糖凝胶具有一定孔径,长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一,迁移的速度不同,从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下,插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光,所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料:分子量不同的DNA片段。

(二)仪器设备:1. 电泳仪;2. 紫外检测仪;3. 水平电泳槽;4. 移液器;5. 一次性手套。

(三)试剂:1. pH8.3 Tris-硼酸-EDTA缓冲液:称取10.78gTris,5.500g硼酸,0.930gEDTA-Na2溶于无离子水,定容到100ml,用时稀释10倍;2. EB溶液:溴化乙锭(10mg/ml)(用时稀释10倍);3. 加样缓冲液:50%甘油+0.25%溴酚蓝;4. 琼脂糖。

 三、实验步骤

(一)琼脂糖凝胶的制备:

1. 称取琼脂糖1g,加入10倍电泳缓冲液10ml,再加入蒸馏水90ml,在电炉上加热溶解,配制成1%琼脂糖凝胶;稍凉后加入配好的EB溶液数滴。

2. 将电泳模板两端密封,倒入琼脂糖凝胶溶液,插入梳子。

3. 冷凝后将梳子拨出,电泳胶放入电泳槽中。

(二)加样:取样品溶液20μl,加入1/5体积加样缓冲液,混匀后,将溶液加到样品孔中,同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。一般DNA样品*好控制在0.5~1.0μg之间。

(三)电泳:加入pH8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液,通电维持2~4V/cm,电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。

(四)染色及观察:电泳完毕,取出凝胶模具,将其推到一块干净的玻璃板上,于254nm或300nm波长紫外灯下观察,DNA存在的位置呈现橙黄色荧光,放置时间超过4~6h后荧光减弱,因此应立即用用国产全色胶卷拍照,并应加上红色滤色镜。

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